熒光定量PCR儀分析PCR擴(kuò)增各種模板的引物設(shè)計難度不一。有的模板本身條件比較困難，例如GC含量偏高或偏低，導(dǎo)致找不到各種指標(biāo)都十分合適的引物；在用作克隆目的的PCR因為產(chǎn)物序列相對固定，引物設(shè)計的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件。
　　PCR擴(kuò)增出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶：
　　熒光定量PCR儀的PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：
　　引物與靶序列不*互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體；
　　Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)；
　　酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。
　　對策：必要時重新設(shè)計引物；減低酶量或調(diào)換另一來源的酶；降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)；適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法。
　　PCR擴(kuò)增出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶：
　　PCR擴(kuò)增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對策有：減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶；減少dNTP的濃度；適當(dāng)降低Mg2+濃度；增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。